謝耀堅(jiān)　　　

（國(guó)家林業(yè)局桉樹(shù)研究開(kāi)發(fā)中心　湛江　524022）

摘要　基因工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的代表,近10年基因工程的發(fā)展迅猛，林業(yè)上　已經(jīng)有20多個(gè)樹(shù)種的品系得到了轉(zhuǎn)基因植物,基因工程在林業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要包括以下方　面：提高植物的光合效率；增強(qiáng)植物抗病蟲(chóng)害的能力；生物固氮；增強(qiáng)和改良種子貯藏蛋　白；培育抗除草劑作物等,

關(guān)鍵詞　基因工程　生物技術(shù)　林業(yè)

  基因工程是在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)綜合發(fā)展的基礎(chǔ)上于20世紀(jì)70年代誕生的一門嶄　新的生物技術(shù)科學(xué),生物技術(shù)是應(yīng)用于有生命物質(zhì)技術(shù)的總稱，其涵蓋的內(nèi)　容非常廣泛，可以劃分為傳統(tǒng)生物技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)兩種,人類幾千年以來(lái)使用的釀酒,　制醬,育種等技術(shù)是傳統(tǒng)的生物技術(shù)，近20年來(lái)，隨著與生物技術(shù)相關(guān)的諸多理論和技術(shù)　，特別是實(shí)驗(yàn)手段的發(fā)展，便產(chǎn)生了現(xiàn)代生物技術(shù)，并被列入高技術(shù)領(lǐng)域,基因工程是現(xiàn)代　生物技術(shù)的代表,林木基因工程是通過(guò)適合的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，導(dǎo)入有用的外　源基因，獲得轉(zhuǎn)基因植物，從而進(jìn)行林木遺傳改良或有關(guān)的研究.

  在最近10多年內(nèi)，植物基因工程已獲得了一批轉(zhuǎn)基因植物，其中包括改變植物品質(zhì)及適　應(yīng)性的轉(zhuǎn)基因植物,抗病蟲(chóng)害的轉(zhuǎn)基因植物,抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植物等等,1986～1997年期間，全世界有45個(gè)　國(guó)家在60多種植物上進(jìn)行了2．5萬(wàn)例轉(zhuǎn)基因植物的田間試驗(yàn)，僅1996～1997年即約有1．0萬(wàn)例　的報(bào)道,據(jù)估計(jì)，全球轉(zhuǎn)　基因植物產(chǎn)品的市場(chǎng)銷售額從1996年的不足5億美元，到2000年將增加到70～100億美元,在　林業(yè)上，自1987年Fillatti，J．J．等獲得第一株轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)植物以來(lái)，已有楊屬,落葉松屬,　云杉屬,松屬,栗屬,胡桃,刺槐,愷木,桉樹(shù),蘋果,李和葡萄等20多個(gè)樹(shù)種得到了轉(zhuǎn)基　因植物,我國(guó)科學(xué)家在＂七五＂,＂八五＂和＂九五＂攻關(guān)期間，成功地進(jìn)行了楊樹(shù),松樹(shù)　和桉樹(shù)等樹(shù)種的遺傳轉(zhuǎn)化，系統(tǒng)地掌握了各種遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系，為開(kāi)展轉(zhuǎn)基因工程的實(shí)際　應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).
^{1　提高作物光合效率的基因工程}

  ^{用傳統(tǒng)的育種方法育種，并不能選育出具有高光合效率的品種，而應(yīng)用植物基因工程可　以從根本上解決這一問(wèn)題,光合作用通過(guò)光反應(yīng)和暗反應(yīng)將光能轉(zhuǎn)變成化學(xué)能，并固定CO2，二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）是固定CO_２的關(guān)鍵酶，存在于葉綠體中的這種酶催化C　O_２與二磷酸核酮糖反應(yīng)，形成磷酸甘油酸，這個(gè)固定CO_２的作用稱為羧化反應(yīng),同時(shí)，R　ubisco還能催化加氧反應(yīng)，即光呼吸，這一過(guò)程涉及氧的凈吸收和CO_２的釋放，是一個(gè)浪　費(fèi)的過(guò)程，因?yàn)樗粌H使已經(jīng)固定的碳丟失，而且使Rubisco在CO_２的固定中發(fā)生逆轉(zhuǎn),這　決不是一種無(wú)足輕重的損失，因?yàn)楫?dāng)光呼吸被抑制后，CO_２凈固定率可以提高50％,應(yīng)用植　物基因工程技術(shù)能降低Rubisco加氧酶的功能而不影響其羧化酶的功能，即能使其它限制光　合作用的因素仍然保持不變，作物的生產(chǎn)能力卻可以顯著提高,但這在植物基因工程中是一　項(xiàng)艱巨的工作，需要很長(zhǎng)時(shí)間才能收到實(shí)效.}

^{2　增強(qiáng)植物抗病害能力的基因工程}

  ^{利用植物基因工程來(lái)防治病毒危害，目前已取得令人矚目的成就，主要有6種方法：（1　）向植物中轉(zhuǎn)入病毒的外殼蛋白基因；（2）向植物中轉(zhuǎn)入病毒的衛(wèi)星RNA基因；（3）利用　病毒的反義RNA；（4）利用植物自己編碼的抗病基因；（5）利用Ribozyme裂解酶病毒基因　組；（6）利用病毒上的其它基因,迄今為止，植物抗病基因工程大多是依據(jù)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?！檩d體的隨機(jī)整合策略,抗細(xì)菌性病害的基因工程主要采取對(duì)病原細(xì)菌有解毒作用的解毒活　性基因和T4　溶菌酶基因等方法,抗林木病毒性病害的基因尚未很好研究和克隆,抗真菌性　的病害研究方面，目前克隆出幾丁質(zhì)酶基因和角質(zhì)酶基因，已構(gòu)建了能在楊樹(shù)細(xì)胞　中表達(dá)的幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)系統(tǒng),誘導(dǎo)和激發(fā)樹(shù)木本身防衛(wèi)系統(tǒng)啟動(dòng)，涉及木質(zhì)素,黃酮　類色素和植保素的合成的酶類基因如苯丙氨酸裂解酶,查爾酮合成酶,水楊酸合成酶基因，　微生物源,動(dòng)物（如昆蟲(chóng),兔防御素基因）異源,植物異源次生代謝物合成的研究等對(duì)林木　抗病基因工程具有重要意義,目前國(guó)內(nèi)外轉(zhuǎn)基因的抗楊樹(shù)葉銹病,抗楊樹(shù)葉枯　病,抗日本山楊腫瘤病,抗栗疫病,抗南方松棱形銹病,抗桉樹(shù)青枯病等轉(zhuǎn)基因工程研究正　在進(jìn)行中
3　增強(qiáng)植物抗蟲(chóng)能力的基因工程}

  ^{蟲(chóng)害是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的另一大害，化學(xué)藥劑殺蟲(chóng)不僅成本高，而且嚴(yán)重污染環(huán)境,現(xiàn)在科　學(xué)家轉(zhuǎn)向用植物基因工程的方法來(lái)達(dá)到控制蟲(chóng)害的目的,很早人們就知道蘇云金桿菌能夠殺　死一些昆蟲(chóng)，目前已弄清楚其殺蟲(chóng)機(jī)制在于這種桿菌體內(nèi)有一種結(jié)晶的蛋白毒素：δ內(nèi)毒素　，它能引起鱗翅目昆蟲(chóng)神經(jīng)中毒最后死亡,1987年人們成功地從不同蘇云金桿菌中分離出了　這種毒素的基因,比利時(shí),美國(guó)和瑞士的科學(xué)家分別把基因轉(zhuǎn)入煙草,番茄和馬鈴薯中，結(jié)　果這些轉(zhuǎn)基因植物殺蟲(chóng)效果良好，毒素基因還能穩(wěn)定遺傳，而且毒素對(duì)人畜無(wú)害,除了蘇云　金桿菌的δ內(nèi)毒素以外，英國(guó)的科研人員還克隆了豇豆的胰蛋白抑制劑基因,將這種基因轉(zhuǎn)　入植物，它產(chǎn)生的抑制劑能破壞蟲(chóng)子體內(nèi)的胰蛋白酶的活性，蟲(chóng)子吃了轉(zhuǎn)基因植物的葉片后　就會(huì)因消化不良而死亡,目前的抗蟲(chóng)植物基因工程，普遍遇到的困難就是毒蛋白或蛋白酶抑　制劑基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平較低.}

  ^{McNabb等于1987年將Pin-Ⅱ基因?qū)霔顦?shù)NC5399無(wú)性系，轉(zhuǎn)化植株已進(jìn)入田間抗蟲(chóng)實(shí)　驗(yàn)階段,1988年美國(guó)依阿華大學(xué)利用從馬鈴薯中提取的蛋白抑制劑基因，以農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒為　載體轉(zhuǎn)化楊樹(shù)雜種無(wú)性系，獲得抗卡拉酶素植株,1990年我國(guó)南京林業(yè)大學(xué)將農(nóng)桿菌C58菌　株轉(zhuǎn)入小葉楊和歐美楊，將農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)入毛白楊分別獲得成功,1991年Mcoown，B．　H．等人利用電擊法將抗蟲(chóng)Bt基因?qū)脬y白楊與大齒楊,歐美黑楊與毛果楊的雜種中，并獲得　抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植株；美國(guó)威斯康星大學(xué)麥迪遜分校成功地將抗蟲(chóng)Bt基因,蛋白酶抑制劑基因（　CPTI）導(dǎo)入白云杉中，有效地防止了卷葉蛾的危害；伍寧豐等（1991）以歐洲黑楊為研究對(duì)　象，將Bt抗蟲(chóng)基因?qū)肴~片，得到轉(zhuǎn)化植株,1995年，法國(guó)樹(shù)林育種實(shí)驗(yàn)站Gills　Pilate領(lǐng)　導(dǎo)的研究小組，將切割蛋白基因轉(zhuǎn)入楊樹(shù)中，所得轉(zhuǎn)化植株可使食其葉片的昆蟲(chóng)致死率達(dá)40?。ブ?/sup>,1993～1997年間，中國(guó)林科院與中國(guó)科學(xué)院合作將Bt基因?qū)霘W洲黑楊,歐美楊和　美洲黑楊中，獲得對(duì)舞毒蛾有毒殺作用的楊樹(shù)轉(zhuǎn)化再生植株，并進(jìn)入田間測(cè)定,中國(guó)科學(xué)院　,中國(guó)林科院,南京林業(yè)大學(xué),中國(guó)農(nóng)科院等單位，先后單獨(dú)或合作研究獲得了轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因　的黑楊,歐美楊雜種,毛白楊,美洲黑楊與小葉楊雜種NL-80106，以及轉(zhuǎn)Aalt蝎神經(jīng)毒素　基因的NL-80106楊樹(shù)無(wú)性系，并進(jìn)入田間試驗(yàn)階段,初步結(jié)果表明，楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因無(wú)性系的　抗蟲(chóng)效果顯著，為防治楊樹(shù)人工林大面積的蟲(chóng)害創(chuàng)造了條件.
4　生物固氮的基因工程}

^{生物固氮的基因工程是一項(xiàng)艱巨而又有巨大效益的研究，有可能進(jìn)行基因操作的機(jī)會(huì)是?。骸」痰驈募?xì)菌轉(zhuǎn)移到植物中，共生的宿主范圍由豆科植物擴(kuò)大到非豆科植物，增加了共生　細(xì)菌固氮的效率,固氮基因在高等植物中轉(zhuǎn)移和表達(dá)很復(fù)雜，固氮酶對(duì)氧不穩(wěn)定，必須有一　些防止固氮酶被氧抑制的方法,固氮菌本身靠快速呼吸降低氧的張力，并且根瘤菌瘤中豆根　瘤蛋白的存在促使氧擴(kuò)散到類菌體而不使固氮酶失活,同時(shí)，需要外加的宿主基因來(lái)同化和　轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生的氨,另外，細(xì)菌的基因調(diào)控序列還要修飾高等植物的表達(dá)，這方面的研究正在進(jìn)　行中,
5　增加和改良種子貯藏蛋白的基因工程}

  ^{很多農(nóng)林作物均以收獲種子或果實(shí)作為目的,谷粒的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量完全取決于貯藏蛋白的氨　基酸成分,單子葉植物和雙子葉植物的種子蛋白在氨基酸含量上有較大差異,大部分的谷類　作物，如小麥等種子中的賴氨酸含量很低，而大部分雙子葉植物種子中都含有這種氨基酸，　但缺少蛋氨酸,在蛋白質(zhì)的合成中當(dāng)一種氨基酸處于極限時(shí)，其它氨基酸就不能被貯藏而是　被分解掉,賴氨酸是谷物中頭一個(gè)極限氨基酸，因此，在一種純谷類飲食中含有的賴氨酸處　于極限狀態(tài)，其質(zhì)量將是低劣的，因?yàn)楣攘５鞍踪|(zhì)不能被人體有效地利用,同樣，豆科植物　貯藏蛋白缺乏蛋氨酸,所以將雙子葉植物的種子蛋白如大豆的貯藏蛋白基因轉(zhuǎn)移到禾谷類　作物上，就可以達(dá)到所需的氨基酸平衡,將額外的賴氨酸密碼子插入已克隆的貯藏蛋白基因　組DNA中，隨后再把這種基因引入植物中，或者是將已有的基因經(jīng)過(guò)堿基突變，以優(yōu)先合成　極限氨基酸含量高的蛋白,目前，已對(duì)克隆的豆科植物貯藏蛋白和谷類貯藏蛋白基因，如麥　醇溶蛋白,玉米醇溶蛋白基因等，進(jìn)行了序列分析，有關(guān)控制它們的表達(dá)和涉及基因數(shù)量的　知識(shí)也在不斷積累，轉(zhuǎn)基因的植物也已經(jīng)培育出來(lái),澳大利亞科學(xué)家將豆類蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)　移到奶牛吃的牧草里，奶牛吃了這種牧草后所產(chǎn)生的奶中就含有了較多的人體必需的氨基酸.
6　培育抗除草劑作物的基因工程}

  ^{這是一項(xiàng)比較成功的植物基因工程，一些技術(shù)發(fā)達(dá)的國(guó)家，如美,英,法,德,比利時(shí)　等都非常重視這項(xiàng)技術(shù),目前世界上采用的除草劑主要分兩大類，一類主要是通過(guò)破壞氨基　酸合成途徑來(lái)殺死雜草；另一類是通過(guò)破壞植物光合作用中電子傳遞鏈的蛋白來(lái)殺死雜草,　根據(jù)除草劑的不同特點(diǎn)，可以采用幾種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)抗除草劑的基因工程,第一種方法，把與　除草劑作用的酶或蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)進(jìn)植物中，使其拷貝數(shù)增加，因而轉(zhuǎn)基因植物中這種酶或　蛋白的量大大增加,如果除草劑的濃度不足以全部破壞植物體內(nèi)的這種酶或蛋白，那么就不　能把植物殺死，而雜草則因?yàn)槊负偷鞍妆怀輨┢茐亩粴⑺?/sup>,一個(gè)成功的例子就是將EPSP　合成酶基因轉(zhuǎn)入抗除草劑植物中,廣譜除草劑glyphosate就是以EPSP合成酶為　目標(biāo)，破壞其結(jié)構(gòu)，從而破壞氨基酸的合成途徑,1987年美國(guó)科學(xué)家成功地將EPSP合成酶基　因轉(zhuǎn)進(jìn)油菜細(xì)胞的葉綠體中，轉(zhuǎn)基因植物葉綠體中EPSP合成酶活性大大提高，并能抵抗glyp　hosate的作用,第二種方法是轉(zhuǎn)移一種能以除草劑為底物的酶的基因到植物中，該基因編碼　的酶在轉(zhuǎn)基因植物中將除草劑催化掉，從而保住植物不被殺死,這種方法成功的例子就是抗　磷酸麥黃酮的基因工程,還有一種方法，針對(duì)除草劑能識(shí)別其作用的酶上的一定位點(diǎn)這一特　點(diǎn)，人們用基因突變的方法使該位點(diǎn)上的相應(yīng)氨基酸發(fā)生突變，但這種突變并不損失這個(gè)酶　的二級(jí)結(jié)構(gòu)和酶促功能，只是除草劑不能識(shí)別它，這樣轉(zhuǎn)基因植物就表現(xiàn)出對(duì)除草劑不敏感　,Fillatti．J．J．等于1987年，以根瘤農(nóng)桿菌為載體，將抗除草劑基因（aroA基因）轉(zhuǎn)入楊　樹(shù)NC5339無(wú)性系中，獲得一批抗除草劑（草甘磷）轉(zhuǎn)化植物,1987年美國(guó)首次報(bào)道成功地將抗　除草劑基因?qū)脬y白楊與大齒楊的雜種無(wú)性系中并進(jìn)入田間試驗(yàn)，隨后美國(guó)又成功地將抗除　草劑的基因轉(zhuǎn)入美洲黑楊,落葉松中，引發(fā)了一場(chǎng)轉(zhuǎn)基因工程的熱潮,目前，轉(zhuǎn)基因的美洲　黑楊已被密西西比河流域的一些企業(yè)應(yīng)用.
7　植物基因工程在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的其它應(yīng)用}

  ^{除上述方面外，植物基因工程在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中的其它應(yīng)用還包括：在作物雄性不育性研　究中的應(yīng)用；利用植物基因工程提高作物抗逆性，如抗冷,抗熱,抗旱,抗?jié)车哪芰Φ?；利　用植物基因工程生產(chǎn)醫(yī)療保健用品等,我國(guó)在包括木本植物在內(nèi)的許多植物對(duì)逆境條件的反　應(yīng)研究中，取得了重要進(jìn)展，已有研究表明，不同的逆境條件脅迫引起的反應(yīng)有許多相似之　處，例如，干旱,鹽堿和低溫等不同的逆境都引起滲透脅迫,目前參與植物對(duì)滲透脅迫反應(yīng)　的ABA調(diào)節(jié)調(diào)滲蛋白，與抗逆代謝相關(guān)的基因如與抗（耐）鹽有關(guān)的脯氨酸合成酶基因，與　抗凍抗寒相關(guān)的魚(yú)抗凍蛋白（AFP）基因,甜菜堿,葡萄糖合成酶，與葉綠體有關(guān)的甘油-3　-磷酸脂?；D(zhuǎn)移酶基因，與抗旱有關(guān)的繭蜜糖合成酶基因，與樹(shù)木抗污染有關(guān)的起活性氧　化解毒作用的谷光甘肽還原酶基因已被克隆，部分已被轉(zhuǎn)入樹(shù)木,我國(guó)的抗鹽基因工程也取　得很大進(jìn)展，中國(guó)科學(xué)院,中國(guó)農(nóng)科院等單位克隆和合成了脯氨酸合成酶基因（proA）,山　菠菜堿脫氫酶（BADA）,磷酸甘露醇脫氫酶（mtlD）及磷酸山梨醇脫氫酶（gutD）等與耐鹽相關(guān)基　因,通過(guò)轉(zhuǎn)化山菠菜堿脫氫酶（BADA）,磷酸山梨醇脫氫酶（gutD）基因，獲得耐鹽楊樹(shù)的研究　正在進(jìn)行中.}

  ^{科學(xué)家預(yù)言，21世紀(jì)將是生物學(xué)的世紀(jì)，未來(lái)的10年，將是植物基因工程技術(shù)迅速發(fā)展　的10年，也是這種高技術(shù)開(kāi)始顯示出巨大生產(chǎn)力的10年，除了已獲得的有重大價(jià)值的轉(zhuǎn)基因　植物進(jìn)入生產(chǎn)使用以外，還將在轉(zhuǎn)基因技術(shù),分離優(yōu)良性狀基因技術(shù)等方面取得重大突破,　我們相信，被認(rèn)為是最具有現(xiàn)實(shí)意義的植物基因工程技術(shù)，必將在21世紀(jì)出現(xiàn)的第二次＂綠色　革命＂中發(fā)揮巨大的作用.}

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APPLICATION　OF　GENE　ENGINEERING　IN　FORESTRYXie　Yaojian?。–hina　Eucalypt　Research　Center，　Zhanjiang　，Guangdong，　524022）